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Por José Alfonso Álvarez González La Biorremediación es el proceso mediante el cual se añaden materiales al ambiente contaminado para ser remediados biológicamente. Esta comenzó a desarrollarse en las décadas de los 60, y ha sido aplicada exitosamente en el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos desde los años 80 y 90. Se caracteriza por ser una técnica de bajo costo de operación y ambientalmente segura. Resumen De la zona de la Reserva Ecológica del Ingenito, ubicada en la Bahía de la Habana, se toman muestras de suelo costero contaminados con hidrocarburos petrolizados con vistas a realizar experimentos de Biotratamiento, por el método de Bioestimulación, a escala de laboratorio, simulando las condiciones de tratamiento en campo. Mediante un sistema factorial de 23 se determina que variantes (concentración de hidrocarburos, presencia o ausencia de bagazo y presencia o ausencia de nutrientes) proporcionan una mayor tasa de biodegradación para su posterior aplicación en campo. Se realizan seguimientos de la población bacteriana autóctona del suelo y la producción de CO2. Al mismo tiempo se determina la tasa de biodegradación en el tiempo. Transcurridos los 90 días de experimento, la mayor disminución en los hidrocarburos se obtiene cuando se utilizan separadamente bagazo y nutrientes para ambas concentraciones de hidrocarburos probadas. Introducción La Biorremediación es el proceso mediante el cual se añaden materiales al ambiente contaminado para ser remediados biológicamente (Head, 1998). Esta comenzó a desarrollarse en las décadas de los 60, y ha sido aplicada exitosamente en el tratamiento de suelos contaminados con hidrocarburos desde los años 80 y 90. Se caracteriza por ser una técnica de bajo costo de operación y ambientalmente segura. Esta técnica puede ser aplicada in-situ o ex-situ en dependencia del lugar donde se lleve a cabo el tratamiento, aplicando el método de bioestimulación, la cual se basa en añadir nutrientes para estimular el crecimiento de los microorganismos autóctonos, o por el método de bioaumentación mediante la cual se añaden microorganismos exógenos con capacidad de degradar hidrocarburos. Ya sea por un método u otro, el proceso de biodegradación es mayor como consecuencia de un mejor control / efectividad de los factores abióticos como temperatura, pH, aireación, mezcla, humedad; y bióticos como actividad y crecimiento de los microorganismos que inciden sobre el proceso (Huddleston y Bleckmann, 1986; Infante y Arias, 1993; Ercoli, 2001) Es importante destacar que el factor económico juega un papel importante a la hora de seleccionar el método a emplear, así como también de la rapidez deseada para la limpieza del sitio. Es por ello, que antes de llevar a cabo el tratamiento a gran escala se requiere un estudio previo de estos factores a nivel de laboratorio para su posterior aplicación en campo. Es objetivo de este trabajo es determinar, a escala de laboratorio, la variante que proporcione la mayor tasa de biodegradación, con vistas a biorremediar suelos contaminados con hidrocarburos. Materiales y métodos Toma de Muestras Se tomaron muestras de suelo costero contaminado con hidrocarburos en diferentes puntos de la zona de la Reserva Ecológica del Ingenito, ubicado en la Bahía de la Habana. Las muestras fueron tomadas en forma de estrella y posteriormente se mezclaron todas para garantizar una mayor homogenización y representatividad de la misma. Para la determinación inicial de los análisis químicos, se colectó una fracción de la muestra compósito y se envasó en bolsas de nylon preservándose en congelación hasta su procesamiento. Al mismo tiempo se separó otra fracción de la muestra para el análisis microbiológico. El resto se utilizó para el montaje de los experimentos. Conteo de microorganismos Para el análisis microbiológico se tomaron 10 g de suelo y se disolvieron en 100 ml de solución salina con Tween 80 para lograr la dispersión del hidrocarburo de las partículas del suelo. Luego de ser agitada esta mezcla se realizaron diluciones seriadas y se inoculó una porción de este en medio de agar nutriente. Pasadas las 24 horas de incubación se procedió a la lectura de las mismas (ISO 4833:1991). Producción de CO2 (Respirometría) La medición del CO2 producido por unidad de tiempo en un área determinada es una medida indirecta del proceso biodegradativo ya que tiene como objetivo evaluar la actividad respiratoria de los microorganismos del suelo durante el proceso de degradación de los compuestos orgánicos. Para ello se colocó un recipiente plástico conteniendo KOH (0.1 N) cubierto por otro recipiente de mayor tamaño de forma tal de evitar cualquier intercambio con el ambiente exterior. Estos permanecen durante 18 horas, tiempo en el cual el CO2 desprendido por la actividad biológica es adsorbido por el KOH, este se titula con solución de HCl (0.1 N) y La diferencia entre esta valoración y la obtenida de un blanco, nos da los miligramos de CO2 producidos por m2 por hora (Viale e Infante, 1997). Análisis Químico Las muestras fueron homogeneizadas, secadas en la estufa y tamizadas a través de un tamiz con poro de 2 mm de diámetro. De aquí se tomó una muestra representativa para ser analizada. La determinación de grasas y aceites se realizó por el método de Abboud S.A, 2000 y la determinación de Hidrocarburos totales por el método APHA 5520F.(APHA, 1991; APHA, 1995). Experimentos de Biotratamiento Para seleccionar la variante más factible a utilizar en una escala piloto, fue realizado un diseño factorial completo semicuantitativo 23, donde como variantes independientes se utilizó: X1: Concentración de Hidrocarburo (1 % y 3 %) X2: Presencia – Ausencia de Bagazo X3: Presencia – Ausencia de Nutrientes La composición de cada uno de los experimentos se muestra en la Tabla 1. En todos los casos la masa final fue de 2000 g y la cantidad de Urea y DAP se determinó según la relación C / N = 60 y C / P = 800. Los experimentos (Ver Anexo) fueron aireados de forma manual cada 2 ó 3 días y humedecidos periódicamente para mantener una humedad relativa del 80 % aproximadamente. Se realizaron muestreos mensuales para la determinación de grasas y aceites e hidrocarburos totales y para la determinación de CO2 y conteo bacteriológico. Tabla 1. Composición de los Experimentos. Experimento HC al 1% (g) HC al 3 % (g) Suelo limpio (g) Nutrientes (g) Bagazo (g) Urea DAP 1 657.7 - 1555.6 - - - 2 - 1973.2 666.7 - - - 3 657.7 - 1505.6 - - 50.0 4 - 1973.2 616.7 - - 50.0 5 657.7 - 1555.6 2.54 0.49 - 6 - 1973.2 666.7 2.54 0.49 - 7 657.7 - 1505.6 2.54 0.49 50.0 8 - 1973.2 616.7 2.54 0.49 50.0 DAP: diaminofosfato (fertilizante) Análisis Estadístico Toda la experiencia se realizó con 3 repeticiones. Posterior al análisis de similitud de varianza por el método de Bartlett (Lerch, 1977), se realizó el análisis de varianza de clasificación triple y la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan (Lerch, 1977), en el cual las medias que no se diferencian se expresan con igual letra. En todas las tablas y gráficos se refieren las medias con el intervalo de confianza para un coeficiente de significación del 5 %. Los resultados fueron procesados con el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus. Resultados y discusión Comportamiento de las Poblaciones Microbianas En la Tabla 2 se muestran los resultados mensuales de las concentraciones bacterianas durante el transcurso del experimento. En todos los casos la concentración oscila entre 106 y 107 mayoritariamente, niveles aceptables para el desarrollo de los procesos de biodegradación. De los valores reportados en la tabla y la distribución obtenida de forma gráfica (Figura 1) se evidencia una disminución en la concentración a los 28 días, resultado esperado teniendo en cuenta que al mezclar suelo limpio con suelo contaminado, parte de los biota inicial presente en el suelo limpio pudiera no adaptarse a las nuevas condiciones impuestas. Tabla 2. Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por gramo de suelo. Experimento t =0 días t =28 días t =60 días t =90 días 1 1.11x107 5.44x106 9.59x106 6.76x106 2 2.60x107 4.44x106 1.56x107 3.63x106 3 4.57x107 1.52x107 1.26x107 1.07x107 4 1.57x108 8.89x107 5.22x106 1.21x107 5 7.00x106 4.22x106 1.52x107 2.12x106 6 1.67x107 5.55x106 5.56x106 4.14x106 7 7.64x107 5.55x106 1.56x107 3.69x107 8 5.94x107 1.06x107 3.84x106 2.22x107 En el caso particular del experimento 3, 4, 7 y 8, se observan los mayores valores iniciales (0 – 60 días). Esto pudiera estar justificado por la presencia del bagazo el cual también aporta microorganismos y permite mayor oxigenación del suelo al mejorar la textura del mismo. Además la presencia de nutrientes también favorece este comportamiento para los experimentos 7 y 8. De 60 a 90 los valores de la concentración bacteriana son menores y permanecen estables hasta los 90 días (Figura 1). Figura 1. Comportamiento de las Poblaciones Bacterianas. Producción de CO2 Los valores respirométricos se exponen en la Figura 2, donde se aprecia que en todos los experimentos se observa una disminución inicial en la producción de CO2, esto se corrobora con los valores de Unidades Formadoras de Colonia obtenidos en la Figura 1 y se debe a la adaptación de los microorganismos autóctonos al nuevo ambiente impuesto. Sin embargo, en todos los casos se observan patrones típicos de procesos biodegrativos, lo cual nos dice que se está llevando a cabo la degradación del crudo (Infante, 2001). Figura 2. Producción de CO2. Análisis Químico En la tabla 3 se reportan los niveles de concentración de hidrocarburos totales del petróleo obtenidos a los diferentes tiempos, observándose que ya a los 30 días de iniciado el experimento se obtienen valores aceptables de degradación (mayores del 25 %) (Infante, C, 1999). Esto garantiza que el proceso de biodegradación llevado a cabo es efectivo y que el saneamiento de los suelos por la técnica de Bioestimulación es viable para este tipo de contaminante y bajo estas condiciones (Infante, C; 1999). Las mayores tasas de degradación de hidrocarburos al cabo de los 90 días se obtienen en los experimentos 3 y 4 (con bagazo) y 5 y 6 (con nutrientes), para 1 y 3 % de concentración de hidrocarburos respectivamente. Sin embargo, esto no coincide completamente con los resultados obtenidos del conteo de microorganismos, donde los experimentos 5 y 6 tenían las menores concentraciones bacteriológicas. Quiere esto decir, que los elevados valores en las unidades formadoras de colonias, para los otros experimentos, eran debido a la presencia de bacterias heterótrofas del bagazo y no necesariamente a las bacterias degradadoras. Tabla 3. Concentración de Hidrocarburos totales, expresados en % Experimento t = 0 días t =30 días Tasa de degradación 30 días (%) t =90 días Tasa de degradación 90 días (%) 1 0.5360 0.3300 38.4 0.3350 37.5 2 2.2420 1.4440 35.5 1.4990 33.1 3 0.6690 0.3760 43.8 0.3430 48.7 4 2.3500 1.1830 49.6 1.1570 50.8 5 0.6640 0.3290 50.4 0.3490 47.4 6 2.1510 1.3470 37.4 1.0940 49.1 7 0.5100 0.3440 32.5 0.3670 28.0 8 1.8750 1.3480 28.1 1.0480 44.1 Es bueno resaltar que la determinación cuantitativa de hidrocarburos en suelo es compleja ya que la mayor parte de las técnicas se basan en la extracción de diversas fracciones por solventes. La solubilidad de dichas fracciones en distintos solventes es variable. De allí que, según sea el método utilizado para la determinación de hidrocarburos se obtendrán valores diferentes, que para determinados tipo de suelos e hidrocarburos pueden ser muy marcados (Ercoli, 1999). Por otra parte, resulta difícil la toma de muestra cuando se trata de crudos pesados en suelo y por tales motivos en algunos casos se obtienen mayores valores de hidrocarburos totales a los 90 días que a los 30 días. Sin embargo, los valores son siempre menores que los obtenidos a tiempo cero. Análisis Estadísticos En la tabla 5 se analizan los resultados a los 90 días de iniciado el experimento. Tabla 5. Diferencias en las Tasas de Degradación a los 90 días Experimento Tasa de degradación 90 días (%) 1 37.5 b 2 33.1 c 3 48.7 a 4 50.8 a 5 47.4 a 6 49.1 a 7 28.0 d 8 44.1 ab Si se tiene en cuenta los resultados obtenidos entre las variables 3, 4, 5 y 6 no existen diferencias significativas desde el punto de vista estadístico para un 95 % de confiabilidad de los valores. Las diferencias están dadas para las variantes 1 y 2, donde no hay nutrientes ni bagazo para facilitar la biodegradación y para las variantes 7 y 8 porque se favorecen los heterótrofos no degradadores por la presencia de ambos. Para las variantes 3 y 4 los valores son mayores por el aporte de los microorganismos del bagazo y porque se favorece la aireación del suelo y para las variantes 5 y 6, por la presencia de nutrientes que estimula a los microorganismos autóctonos degradadores. Sin embargo, en sentido general, pudiera aplicarse cualquier variante pues en los 8 experimentos se arrojan resultados satisfactorios, por lo que la mejor variante desde el punto de vista económico serían la 1 y la 2, donde solo se mezcla suelo limpio con suelo contaminado. Conclusiones El análisis estadístico aplicado a los experimentos utilizando suelo impactado del área del Ingenito arrojó que no existen diferencias significativas entre las variantes aplicadas. Las mayores tasas de biodegradación se obtienen cuando se utilizan separadamente material acondicionante y nutrientes, para ambas concentraciones de hidrocarburos. El proceso de biotratamiento es efectivo para este tipo de suelo y de contaminante. Recomendaciones El suelo costero de la zona de la reserva ecológica de la Bahía de la Habana puede ser recuperado mezclando este con suelo limpio y bagazo o nutrientes separadamente, para mayores remociones de hidrocarburos. El uso de uno u otro depende de las condiciones económicas. Sin embargo, no se descarta el saneamiento con sólo airear el suelo con equipos agrícolas. En este caso se obtendrían iguales valores de remoción de petróleo pero en un tiempo más prolongado. www.EcoPortal.net * Lic Esther Ramos Padrón, MSc José Alfonso Álvarez González, Lic Ana Núñez Clemente, Téc. Gisela Novoa Rodríguez, Lic. Sandra Miller Palmer Centro de Investigaciones del Petróleo Washington # 169, Cerro, Ciudad de la Habana, Cuba Bibliografía - Abboud, S.A. (2000) Comunicación Personal. Alberta Research Council. Canada. - APHA. (1992) Standard Methods for the examination of water and wastewater. 17th ed. Ediciones Díaz de Santos S. A., Madrid - APHA (1995) Standard Methods for the examination of water and wastewater. 18th ed. APHA-AWWA- WEF. - Cursi, E.; Calleja, C.(2000) Biorremediación de suelos contaminados con Hidrocarburos. U.E. Mendoza, Argentina. - Ercoli, E.C. (1999) Biorremediación de suelos altamente contaminados. INGEPET 99, Lima, Perú, 1999. - Ercoli E. (2001) Total petroleum hydrocarbon monitoring in biodegradation of weathered crude oily residues. Univ. Nac. de Cuyo, Argentina, 2001 - Ercoli, E. (2001). Análisis y evaluación de parámetros críticos en biodegradación de HC en suelos. Univ. Nac. de Cuyo, Argentina. - Head, J (1998) Bioremediation toward a credible technology. Microbiol. 144: 599 – 608 - Huddleston, R. L. Y Bleckmann, J. R. (1986) Land treatment Biological Degradation Process en Land Treatment: A Hazardous Waste Management Alternative. Edited by Raymond C. Loehr y Joseph F. - Infante, C y Arias, M (1993) Estudio de Variables Bióticas y Abióticas que Inciden en el Proceso de Biodegradación. Revista CODICID. Encuentro de Especialistas en Biotecnología Aplicada a la Industria Petrolera. Memorias P 34 – 38. - Infante, C. (1999).Curso de Biorremediación La Habana. Cuba. - Infante, C. (2001) Comunicación Personal. - ISO 4833:1991 (E) (1991). Microbiology-general guidance for the enumeration of micro organism colony count technique at 30 ° C. - Lerch, G (1977) La experimentación en las ciencias biológicas y agrícolas. Ed. Científico Técnica. La Habana. - Viale, R. e Infante, C. (1997) Protocolo para medir producción de CO2 en suelo. Documento Técnico. INTEVEP. INT- STE – 0966.97.

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