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Por Varios Los manglares están sometidos a diferentes riesgos de contaminación, en especial la industria petroquímica. Contaminantes como el petróleo, metales pesados, residuos industriales y urbanos, afectan directamente la vegetación de los manglares, alterando la capacidad respiratoria y osmoregulatoria de las raíces, pudiendo ocasionar la muerte de las plantas. Introducción Los manglares se desarrollan de manera natural, en las franjas intermareales de las costas tropicales y subtropicales del planeta, constituyéndose de esta manera, en un ecosistema complejo debido a la interacción de cientos de especies de todos los niveles taxonómicas, desde microorganismos hasta especies de mamíferos grandes y vistosas, incluyendo entre todas estas, cientos de clases de peces que son el sustento de muchas comunidades. Todas las especies que interactúan en el manglar tienen su cuenca específica y funciones determinadas, de vital importancia para la dinámica y funcionamiento de estos ecosistemas (FAO – INDERENA, 1984). Estas regiones están sometidas a diferentes riesgos de contaminación debida fundamentalmente a la actividad industrial y portuaria. Dentro de estas actividades la industria petroquímica es una fuente importante de contaminación para estas áreas (Carvalho 2002). Contaminantes como el petróleo, metales pesados, residuos industriales y urbanos, afectan directamente la vegetación de los manglares, alterando la capacidad respiratoria y osmoregulatoria de las raíces, pudiendo ocasionar la muerte de las plantas. Dentro de los resultados que se pueden obtener debido a la contaminación de los manglares se encuentran, entre otros, disminución de la calidad de las aguas, productividad, biodiversidad, valores paisajísticos y estéticos de los ecosistemas marinos.(Fildeman, 1999) Los manglares son los ecosistemas más sensibles a la contaminación petrolera, debido a la toxicidad de los productos derramados y la capacidad de éstos de cubrir raíces, pneumatóforos, corteza de árboles, etc., interfiriendo de esta forma en el metabolismo de la planta, específicamente en el intercambio gaseoso. De igual forma, provoca la desnaturalización de las membranas celulares, reduciendo la transpiración y fotosíntesis, afectando la respiración y reduciendo el crecimiento de la planta (Enciclopedia LAFFER, 2000). En la Empresa de Perforación y Extracción de Petróleo Centro, ubicada en la costa norte de la República de Cuba, ocurrió un avería en el antiguo oleoducto que transportaba el petróleo crudo a la base de supertanqueros, produciendo un vertimiento de este producto a una zona de manglar aledaña, lo que ocasionó una contaminación severa del suelo. Debido a que los manglares son sitios de alta sensibilidad y en los cuales se aplican medidas extremas para su conservación y protección, se requieren tecnologías de saneamientos “in situ” que eviten el daño al ecosistema marino. Una de las tecnologías posibles de aplicar fue la de aplicación de productos con alta carga microbiana para propiciar la biodegradación in situ de los hidrocarburos. Entre estos se encuentran los lodos residuales o fangos digeridos que se obtienen en el proceso de tratamiento de las aguas residuales domésticas e industriales. El lodo suele ser un líquido o semisólido con un contenido en sólido variable, dependiendo de las operaciones de tratamiento recibido, y que suele estar comprendido entre el 0.25% y el 12% en peso (Gutiérrez, J. 2003). El fango (lodo) está formado principalmente por las sustancias responsables del carácter desagradable de las aguas residuales no tratadas; la fracción de lodo a evacuar, generado en el tratamiento biológico está compuesto principalmente por la materia orgánica presente en aquella, aunque en forma diferente a la original, solo una pequeña parte del lodo está compuesto por materia sólida (Gutiérrez, J. 2003). El valor del fango como fertilizante se basa principalmente el contenido de nitrógeno, fósforo y potasio, que debe ser determinado en aquellos casos en los que el lodo se vaya a emplear como acondicionador de suelos (Gutiérrez, J. 2003). El interés en la aplicación del fango al suelo ha aumentado últimamente como consecuencia de la menor disponibilidad y viabilidad de otras operaciones de gestión de los fangos tales como el depósito en vertederos controlados. Una gestión adecuada de los fangos es necesaria debido a la reducción de la disponibilidad de vertederos autorizados o controlados y a las gestiones legales de reutilizar sus propiedades nutritivas (Palacios, 2003). Además al adicionarle lodos de plantas de tratamientos de agua al suelo aumenta el contenido de material orgánico, ya que puede generar una reducción del escurrimiento superficial del agua, favoreciendo la retención de la humedad, mejorando así la actividad biológica y por ende los procesos de mineralización de nutrientes. La actividad microbiana favorece la estabilidad estructural, debido a que el tejido microbiano puede formar una red alrededor de los grupos de partículas minerales. (Dibble y Bartha, 1979). El lodo residual mejora otras propiedades del suelo como son: pH, densidad real, densidad aparente, límite inferior de plasticidad, índice de plasticidad y conductibilidad eléctrica. El objetivo general del presente trabajo es la recuperación del suelo de manglar contaminado por hidrocarburos aplicando el proceso de biorremediación mediante la técnica de bioaumentación, utilizando como bioproducto el lodo residual o fango digerido obtenido en el tratamiento de las aguas residuales albañales Taíno 1, perteneciente a la empresa Aguas Varadero. Los objetivos específicos de este trabajo son: Utilizar las aguas residuales del proceso de obtención de las fibras de henequén como tensoactivo. Determinación de la tensión superficial al agua residual de la producción de henequén. Aislamiento e identificación de cepas de microorganismos degradadoras de las fracciones de hidrocarburos en el lodo residual. Realizar el seguimiento analítico, químico y microbiológico del tratamiento de biorremediación aplicado al suelo de manglar contaminado por hidrocarburos. Materiales y métodos. 1- Tratamiento al manglar impactado por hidrocarburos El manglar contaminado por hidrocarburos pesados abarca un área de 500 m2 de una empresa de perforación y extracción de petróleo ubicada en el norte de la República de Cuba. Se realizaron 3 inoculaciones de lodo residual o fango digerido obtenido en la planta tratamiento de las aguas residuales albañales), en los meses de enero, febrero y marzo con 10, 6 y 8 m3, respectivamente, con vistas a mantener los niveles del lodo en el suelo. El lodo se transportó en carro cisterna de 25 m3 de capacidad y se aplicó mediante la utilización de mangueras acopladas a los carros cisternas tal y como se observa en la Fig. 1. Figura 1. Inoculación del lodo Para aumentar la biodisponibilidad del hidrocarburo presente en el suelo del manglar a la acción de los microorganismos, se utilizaron las aguas residuales de la producción de fibras de henequén, a las que se les determinó la tensión superficial en un tensiómetro de la firma norteamericana, CENCO, modelo 70535. El agua residual fue previamente neutralizada con hidróxido de calcio hasta pH neutro. Se adicionó el agua residual de forma manual, y a razón de 0.12 l del agua residual por m2 de suelo de manglar impactado, en tres ocasiones. 2- Toma de muestra La muestra de suelo fue tomada utilizando un muestreo tipo estrella recomendado por el especialista japonés Dr. Itaru Okuda (OKUDA, 2002). Las muestras fueron colectadas y envasadas en bolsas de aluminio (ISO 5667,1994) y se preservaron en congelación hasta su posterior procesamiento y análisis. Además se homogenizaron, secaron y tamizaron. La muestra de lodo residual o fango digerido fue tomada puntualmente en la descarga final de lodos residuales o fangos digeridos hacia el lecho de secado de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas. La muestra fue envasada en frascos estériles de 1 litro de capacidad y conservadas en frío hasta su utilización en el laboratorio de microbiología (ISO 10381–6, 1993). Posteriormente se realizó el conteo de microorganismos, y se determinó la concentración de nutrientes. 3- Seguimiento analítico del tratamiento Para determinar la efectividad del tratamiento aplicado se realizaron los siguientes análisis físicos – químicos: El % de remoción de hidrocarburos se calculó según la siguiente expresión: Concentración Inicial H/C – Concentración Final H/C % Remoción = ---------------------------------------------------------------------- * 100 Concentración Inicial H/C 4- Reforestación del área de manglar recuperado Se realizó la siembra de forma manual de semillas de manglar (vainas) (Figura 2) para reforestar la zona de manglar recuperada. Las mismas fueron seleccionadas de acuerdo a recomendaciones de personas que habitan en la región. Figura 2.Semillas de manglar 5- Aislamiento de cepas de bacterias del fango digerido o lodo residual Las colonias más representativas crecidas en Agar petróleo se sembraron por agotamiento en medio Agar triptona soya y se incubaron a 37 o C por 24 h. Para la caracterización cultural se observaron las colonias al estereoscopio y para definir las características morfológicas tintoriales se realizó la tinción de Gram. (Bergey´s Manual, 1974) Caracterización de las cepas degradadoras Degradación de Resinas y Asfaltenos: Para determinar la capacidad de estas cepas de degradar crudo pesado se añadió 1% de residuo de destilación mayor que 347 oC y residuo de destilación mayor que 465 oC de Crudo Seboruco en tubos con 9 ml del medio Solanas. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa, los tubos se incubaron durante 21días a 37 0C con un indicador de crecimiento. Hidrocarburos Alifáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos alifáticos del petróleo como única fuente de carbono se añadió 1 % de queroseno y 1% de Isooctano por separado en tubos con 9 ml de medio Solana. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento. Hidrocarburos Aromáticos: Para la determinación de la capacidad de utilización de fracciones de hidrocarburos aromáticos se utilizó 1% de Naftaleno (poliaromático) y 1% de Tolueno (Aromático alquilado) en medio basal Solanas por separado. El Naftaleno, como es un sólido insoluble en agua, se disolvió primero en acetona y luego se añadió al medio. El medio se inoculó con una asada del cultivo de la cepa y se incubaron durante 21 días a 37 0C con indicador de crecimiento. Identificación de las cepas degradadoras: A partir de cultivos frescos de las cepas que crecieron en todos los medios de caracterización se inocularon los Kit de identificación (API 20 NE, 2002) para la identificación de microorganismos Gram negativos no enterobacterias Resultados y Discusión. Agua Residual de la producción de fibras de henequén En la tabla 1 se reportan los resultados de la prueba de tensión superficial realizada a las aguas residuales de la producción de las fibras de henequén. Tabla 1. Valores de Tensión Superficial En la producción de las fibras de henequén se obtienen aguas residuales que muy bien pueden ser utilizadas como tensoactivos debido a la presencia de saponinas, estas aguas residuales presentan un pH muy bajo (< 4) y se infiltran en el manto freático sin recibir tratamiento alguno. Los resultados obtenidos de la prueba de tensión superficial indican que una vez ajustado el pH a valores neutros, estas aguas residuales pueden ser empleadas como tensoactivos debido a que el valor de la tensión superficial del agua residual es inferior a los del agua destilada, tal y como se observa en la tabla anterior. Lodo residual de la planta de tratamiento de aguas albañales domésticas Taíno 1 En la tabla 2 se observa la caracterización microbiológica del lodo residual de la planta de tratamiento de aguas albañales domésticas Taíno 1. Se puede observar la alta carga microbiana degradadora de hidrocarburos presente en este desecho, del orden 107, haciendo posible su utilización como inóculo en el tratamiento de suelos contaminados por hidrocarburos. Tabla 2. Caracterización microbiológica del Fango digerido, expresados en UFC/g. Seguimiento del tratamiento de Biorremediación aplicado al suelo del manglar contaminado por petróleo. La tabla 3 reporta los resultados físico - químicos y microbiológicos del seguimiento analítico realizado al suelo del manglar contaminado por hidrocarburos. Tabla 3. Seguimiento analítico del suelo contaminado del manglar. HCTP: Hidrocarburos Totales del Petróleo. Figura 3. Manglar impactado Se observa una marcada disminución de la concentración de hidrocarburos totales en el tiempo debido a la aplicación combinada del lodo con surfactantes químicos, agua residual de la producción de fibras de henequén, que favoreció una mejor biodisponibilidad del hidrocarburo al ataque de los microorganismos presentes en el lodo residual. Al finalizar el período, 359 días, se logró disminuir la concentración de hidrocarburos totales del petróleo por debajo del 1 %, valor que debe cumplir un suelo remediado por el proceso de biorremediación en el estado de Lousiana, EU. Debe destacarse que en la muestra control de suelo de manglar, donde no se aplicó el lodo residual, la variación en el contenido de hidrocarburos es casi nulo, lo que evidencia las propiedades biodegradativas del producto aplicado. Además, se la presencia de elevadas concentraciones de microorganismos totales y de biodegradadores de hidrocarburos en el tiempo de tratamiento, factor que potencia la descontaminación en suelos impactados por combustibles. Figura 4. Manglar tratado En la Figura 4 se observa de forma cualitativa el suelo de manglar recuperado mediante la aplicación del proceso de biorremediación utilizando el método de bioaumentación en comparación con el manglar impactado al inicio del tratamiento (Fig. 3). Se lograron altos por cientos de reducción, 76,78%, de las fracciones más pesadas del petróleo, Resinas y Asfáltenos, éstos compuestos más resistentes al proceso degradativo, en comparación a resultados obtenidos en la muestra Control. Aislamiento de cepas de bacterias del fango digerido o lodo residual En la tabla 4 y 5 se muestra el resultado de la caracterización física - química y microbiológica del Fango digerido, conteo total de las colonias de bacterias aerobias, hongos y levaduras y microorganismos degradadores expresados en UFC/g. Tabla. 4. Caracterización microbiológica del Fango digerido, expresados en UFC/g. El número de bacterias aerobias alcanzó valores de 109 UFC/g , los hongos y levaduras hasta 105 UFC/g y los microorganismos degradadores de hidrocarburos resultó elevado con valores que alcanzan hasta 106 UFC / g. Estos resultados se corresponden con la amplia flora característica de los suelos (Bergeys, 1994). Tabla. 5. Caracterización física - química del Fango digerido HCTP: hidrocarburos totales del petróleo Este sustrato constituye una fuente rica de materia orgánica con altos contenidos de nitrógeno, fósforo y potasio donde aparece un por ciento elevado de grasas, aceites e hidrocarburos totales disueltos en el sedimento con alta biodisponibilidad y un pH adecuado para el desarrollo de una abundante microbiota adaptada al consumo de crudo y sus derivados. Se aislaron 11 cepas aparentemente diferentes, en la tabla 6 y aparecen las características culturales morfológicas de cada una de ellas. Tabla 6. Características culturales y tintoriales de las cepas aisladas Según se aprecia en la tabla 6 las bacterias presentaron morfología colonial diversa, lo cual está en concordancia con la riqueza nutricional del lodo fluvial de donde provienen. El estudio microscópico mostró formas bacilares, cocobacilos, Gram positivos y negativos, márgenes lisas e irregulares, convexas y planas, de colores verdes, amarillas y rosadas. Las bacterias aisladas resultaron ser 5 cocobacilos positivos, 3 cocobacilos negativos. También aparecieron un bacilo positivo y 2 bacilos negativos Caracterización de las cepas aisladas degradadoras de hidrocarburos Las cepas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13 crecieron en todos los medios con los diferentes sustratos como única fuente de carbono y energía (Tabla 7), estas bacterias tuvieron un óptimo crecimiento al final de la incubación con turbidez y cambio de color (Fig. 13), siendo capaces de degradar todas las fracciones de hidrocarburos a la que fueron expuestas, por lo que constituyen cepas promisorias para utilizarlas con diferentes fines degradativos. Esta versatilidad nutricional es muy importante ya que son pocas las especies microbianas reportadas con potencialidades para degradar varios tipos de hidrocarburos ya que la mayoría de las cepas degradadoras de hidrocarburos pueden mineralizar los compuestos poliaromáticos o alifáticos pero no ambos, lo cual sugiere que estas dos vías pueden ser excluyentes en muchos casos. Sin embargo, en muchas bacterias se han observado los genes que codifican para las enzimas alcano-monooxigenasa y catecol 2,3 dioxigenasa, lo cual indica que las vías degradativas para alcanos e hidrocarburos aromáticos simples alquilados pueden encontrarse simultáneamente (Whyte, Bourbonnié y Creer, 1997). Tabla 7. Resultados de la caracterización de las cepas aisladas del residuo con los diferentes hidrocarburos Reforestación del área de manglar recuperado Al evaluar la siembra de las semillas de mangle amarillo plantadas en el área de manglar recuperado se observa que las mismas, al tiempo de realización de este informe, se encuentran en estado de germinación, con coloración verde, indicativo de que las semillas están en proceso de crecimiento y desarrollo, por lo que se recomienda evaluar periódicamente la reforestación del área recuperada. Además, se hace necesaria la evaluación integral, flora y fauna, del manglar con el objetivo de conocer si la aplicación del lodo residual afectó de forma negativa la vida de animales y plantas oriundos de estos ecosistemas. Conclusiones La biorremediación por la técnica de bioaumentación aplicando como bioproducto un lodo residual proveniente de una planta de tratamiento de aguas residuales domésticas, a un área de manglar impactada por hidrocarburos, resulto satisfactoria al lograrse valores de hidrocarburos totales del petróleo inferior al 1 %. El fango digerido de las plantas de tratamiento de aguas residuales constituye una fuente importante de microorganismos degradadores de hidrocarburos, por lo que es promisoria su utilización en el proceso de biorremediación de suelos impactados por hidrocarburos. Se lograron % de remoción de hidrocarburos significativamente elevados para el proceso de biorremediación aplicado. Se identificaron 5 cepas Gram negativas, resultando ser géneros comúnmente aislados de suelo y lodos. Del total de las bacterias aisladas del lodo residual estudiado, siete resultaron las de mejores resultados biodegradativos utilizando al crudo y sus derivados como única fuente de carbono y energía. Las cepas denominadas LR-1, LR -2, LR -3, LR -5, LR -7c, LR -9 y LR -13, son promisorias para su aplicación en diferentes procesos de Biorremediación. Recomendaciones Evaluar la flora y fauna del área de manglar recuperado mediante la aplicación de lodos o fangos digeridos de las plantas de tratamiento de aguas residuales domésticas e industriales como inóculo o bioproducto. Evaluación toxicológica del suelo de manglar recuperado. www.ecoportal.net MSc. José Alfonso Álvarez González, Téc. Gisela Novoa Rodríguez, Ing. Roberto Romero Silva, Dr. Miguel A. Díaz Díaz, Lic. Sandra Millar Palmer, Tec. Ahiram López Díaz, Téc. Cristina Laffita Rivera. Bibliografía Abboud, S.A. Comunicación Personal. Alberta Research Council. 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